PEWARNAAN BAKTERI

 

 

 

 

 

 

 

PEWARNAAN BAKTERI

(Laporan Praktikum Mikrobiologi Pertanian)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Oleh

 

Jenita Rahma Aulia

1614121012

Kelompok 3

 

 

 

 

 

 

 

 

JURUSAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS LAMPUNG

2017

 

 

 

 

 

 

I.         PENDAHULUAN

 

 

 

 

1.1    Latar Belakang

 

 

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri.  Bakteri memiliki ukuran mikrokopis atau tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.  Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan, sehingga akan kesulitan jika kita ingin mengetahui ukuran dan bentuk sel bakteri.  Salah satu cara untuk mengidentifikasi bakteri dengan mudah yaitu menggunakan metode pengecatan atau pewarnaan.  Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya, seperti mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.  Secara umum, tujuan dari pewarnaan bakteri adalah untuk memberikan atau meningkatkan kontras pada bakteri dan latar belakangnya.

 

Dalam pewarnaan bakteri terdapat tiga metode yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan gram dan pengujian menggunakan KOH.  Pewarnaan sederhana dilakukan hanya dengan menggunakan pewarnaan tunggal.  Pewarnaa tunggal terdiri dari methylene blu, basic fuchsin dan crystal violet.  Pewarna tersebut dipilih sebagai pewarnaan bakteri karena bersifat basa dan alkali.  Bakteri menyukai sifat basa, sehingga pewarna tunggal cocok digunakan untuk bakteri.  Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan kelompok bakteri gram positif dan gram negatif.  Pewarnaan gram menggunakan pewarna utama kristas violet dan pewarna tandingan safranin.  Bakteri gram positif mengandung protein dan menunjukan warna ungu apabila diuji dengan alkohol, sedangkan bakteri gram negatif mengandung lemak dan akan berwarna merah apabila diberi alkohol.  Pengujian KOH dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya lendir pada bakteri.  Semua pengujian menggunakan bakteri yang telah mati.

 

Ketiga metode yang digunakan dalam pewarnaan bakteri memiliki perbedaan cara perlakuannya.  Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk melakukan metode pewarnaan sederhana, pewarnaan gram dan pengujian KOH agar praktikan dapat membedakan warna dan bentuk sel dari bakteri.

 

 

1.2    Tujuan

 

 

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut.

1.        Mempelajari cara pewarnaan sederhana untuk mengamati bentuk sel bakteri.

2.        Mempelajari cara pewarnaan gram untuk membedakan warna antara kelompok bakteri gram positif dan gram negatif.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

II.      TINJAUAN PUSTAKA

 

 

 

 

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya.  Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya.  Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.  Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat.  Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus, sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif.  Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro, 1998).

 

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884.  Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja.  Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.  Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya, sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.  Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.  Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam).  Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna.  Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa.  Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo, 1990).

 

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam.  Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif.  Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat.  Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan.  Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel.  Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Sutedjo, 1991).

 

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.  Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri.  Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam.  Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya.  Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit.  Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Waluyo, 2004).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

III.        METODOLOGI

 

 

 

 

3.1    Alat dan Bahan

 

 

Adapun alat dan bahan yang digunaka dalam praktikum ini antara lain gelas benda, lampu bunsen, pinset, kapas, tisu, mikroskop dan contoh inokulum bakteri, bahan-bahan pewarna gram (kristal violet, iodium, KI, alkohol 95% dan safranin), larutan yodium serta alkohol 95%.

 

 

3.2    Prosedur Kerja

 

 

Pada pewarnaan sederhana yang pertama dilakukan adalah membersihkan object glass dengan kapas, kemudian dipindahkan biakan bakteri tersebut dalam bentuk padatan dengan menggunakan inokulum.  Setelah itu, biakan bakteri dikeringkan dengan cara object glass dilewatkan di atas api bunsen sebanyak 3 kali.  Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna safranin dan ditunggu selama 30 detik.  Object glass yang telah diberikan pewarna safranin, dicuci dengan akuades, kemudian dikeringkan dengan tisu.  Hasil pewarnaan tersebut, kemudian diletakkan di meja pentas mikroskop majemuk.  Diatur kefokusan dan perbesarannya, lalu diamati warna, bentuk dan ukuran bakteri.

 

Pada pewarnaan gram hal yang pertama dilakukan adalah dibuatkan olesan tipis bakteri pada object glass dan dibiarkan kering di udara.  Setelah itu, biakan bakteri di object glas difiksasi dengan cara dilewatkan object glass tersebut beberapa kali di atas api bunsen.  Ditetesi larutan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit.  Kemudian, dicuci dengan air kran yang mengalir.  Selanjutnya, ditetesi dengan larutan yodium dan dibiarkan selama 1 menit, lalu cuci dengan air.  Setelah itu, dicuci kembali dengan alkohol 95% sampai warna yodium tidak tersisa.  Ditetesi larutan safranin selama 1 detik lalu dicuci dengan air kran sampai tidak ada lagi warna yang luntur.  Biakan bakteri yang sudah dicuci dikeringkan dengan kertas tisu dan dibiarkan mengering, lalu diamati menggunakan mikroskop.

 

Pada pengujian bakteri yang menggunakan pengujian KOH dilakukan dengan dicuci atau dibersihkan objec glass.  Diambil biakan bakteri menggunakan inokulum, kemudian dikeringkan di atas api bunsen.  Setelah itu, ditetesi larutan KOH menggunakan pipet tetes.  Selanjutnya dikeringkan kembali dengan api bunsen, kemudian ditutup dengan kaca object glass.  Diamati apakah terlihat ada lendir atau tidak, jika ada berarti bakteri tersebut termasuk bakteri gram positif.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IV.        HASIL DAN PEMBAHASAN

 

 

 

 

4.1    Hasil Pengamatan

 

 

Adapun hasil pengamatan dari praktikum ini adalah sebagai berikut.

No	Gambar	Keterangan
1.	Pewarnaan Sederhana	Perbesaran 40x Bentuk tabung Warna ungu
2.	Pewarnaan Gram	Perbesaran 40x Bentuk bulat Warna pink atau kemerahan
3.	Pengujian KOH	Warna bening keputihan dan tidak berlendir

4.2         Pembahasan

 

 

Pada praktikum ini telah dilakukan percobaan pewarnaan bakteri.  Perwarnaan bakteri yang dilakukan adalah pewarnaan sederhana, pewarnaan gram dan pengujian KOH.  Pada pewarnaan sederhana, kami menggunakan pewarna safranin.  Pewarna safranin sangat cocok digunakan karena bersifat basa yang disukai oleh bakteri, sehingga bakteri dapat menyerap pewarna safranin dengan baik.  Pewarnaan yang dihasilkan pada pewarnaan sederhana adalah warna ungu.  Warna tersebut didapat pada perbesaran 40x mikroskop majemuk.  Warna ungu menggambarkan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri gram positif yang mengandung protein.  Biakan bakteri berbentuk tabung dan ada beberapa gambar yang diaamati bentuknya tidak teratur.  Pewarnaan sederhana bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri dan latar belakangnya.  Pada percobaan pewarnaan gram, kami menggunakan alkohol 95% yang bertujuan untuk mengetahui dinding sel bakteri apakah memperbesar ataukah mengerut.  Selain itu, pewarna yang digunakan adalah kristal violet dan safranin.  Biakan bakteri yang diberikan perlakuan pewarnaan gram diamati menggunakan mikroskop majemuk.  Setelah diamati dengan perbesaran 40x, didapatkan warna bakteri yang menunjukan warna pink kemerahan dengan bentuk yang terlihat agak membulat walaupun sedikit tidak jelas.  Warna pink menunjukkan bahwa biakan bakteri tersebut mengandung lemak.  Pemberian alkohol pada praktikum pewarnaan gram ternyata menyebabkan terekstraksinya dinding sel, sehingga pewarna safranin dapat masuk dan akhirnya sel berwarna pink kemerahan.  Pada percobaan pengujian dengan KOH, telah didapatkan biakan bakteri yang berwarna bening keputihan dan tidak berlendir.  Artinya biakan bakteri tersebut adalah bakteri gram positif karena tidak mengandung lendir.

 

Xanthomonas adalah bakteri yang berbentuk batang dengan kedua ujung membulat, berukuran pendek, dengan panjang berkisar antara 0,7-2.0 µm dan lebar antara 0,4-0,7 µm, memiliki satu flagel, tanpa spora.  Ciri khas genus Xanthomonas adalah koloninya berlendir, dan menghasilkan pigmen berwarna kuning yang merupakan pigmen xanthomonadin.  Bentuk koloni pada medium biakan adalah bulat, cembung dan berdiameter 1-3 mm.  Umumnya genus Xanthomonas merupakan bakteri patogen.  Sebagai tambahan, kebanyakan dari anggota Xanthomonas digolongkan sampai dengan pathovar, untuk Xanthomonas campestris berisi lebih dari 140 pathovar.  Umumnya pengelompokan pathovar didasarkan pada jenis inang.  Adapun spesies yang banyak dikenal sekarang adalah X. axonopodis pv. citri, X. campestris pv. vesicatoria, X. campestris pv. campestris, X. oryzae pv. oryzae.  Xanthomonas masuk ke jaringan tanaman melalui hidatoda pada tepi daun, akar yang terputus, ataupun luka pada daun.  Sumber inokulum bakteri ini adalah melalui benih, alat-alat pertanian, anakan yang terinfeksi, dan gulma yang menjadi inang.  Penyebaran inokulum dibantu oleh angin, hujan, dan saluran irigasi.  Bakteri dapat menghasilkan lendir yang kemudian mengeras menjadi butiran kecil pada permukaan daun yang terinfeksi.  Permukaan daun yang lembap dapat melarutkan sel bakteri, sehingga sel bakteri dapat tersebar bebas.  Di samping itu, bakteri dapat bertahan dalam tanah selama 1-3 bulan, dan 7-8 bulan pada benih.  Suhu optimum untuk pertumbuhan Xanthomonas antara 25⁰C- 30⁰C dan suhu minimum berkisar antara 5-10⁰C.  Suhu yang cocok untuk pertumbuhan awal adalah 20⁰C pada suspensi yang agak encer.  Derajat keasaman (pH) untuk menumbuhkan bakteri ini berkisar antara 6,2-6,4 atau yang berbeda tergantung strain bakteri dan medium yang dipakai.

Berikut ini merupakan klasifikasi dari bakteri Xanthomonas campestris:

Kingdom         :Bacteria

Phylum            :Proteobacteria

Class                :Gamma Proteobacteria

Order               :Xanthomonadales

Family             :Xanthomonadaceae

Genus              :Xanthomonas

Species            :Xanthomonas campestris (Lay, 1994).

 

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan untuk mempercepat pewarnaan mikrobia, sehingga zat akan terikat lebih mudah di dalam jaringan dan penggunaan zat warna penutup untuk memberikan warna kontras pada sel mikrobia, yang diwarnai yang tidak menyerap warna pula.  Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus, sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.  Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Soetrarto, 1995).

 

Gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop.  Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan.  Sekitar 90 persen dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan, sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1.        Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

2.        Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal.  Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.  Mengandung asam tekoat.

3.        Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4.        Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5.        Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6.        Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7.        Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.

8.        Tidak peka terhadap streptomisin.

9.        Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin (Waluyo, 2004).

 

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop.  Bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel.  Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya.

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1.        Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

2.        Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam.

3.        Lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

4.        Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5.        Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

6.        Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

7.        Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

8.        Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.

9.        Peka terhadap streptomisin.

10.    Toksin yang dibentuk Endotoksin (Waluyo, 2004).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

V.            KESIMPULAN

 

 

 

 

Adapun kesimpulan dari praktikum ini adalah sebagai berikut.

1.      Pada percobaan pewarnaan sederhana, biakan bakteri Xanthomonas campestris diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40x, didapatkan bentuk bakteri seperti tabung, berwarna ungu.

2.      Pada percobaan pewarnaan gram, biakan bakteri Xanthomonas campestris diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40x menghasilkan bentuk bakteri yang tidak teratur, membulat dan berwarna ungu yang menunjukkan bakteri gram positif.

3.      Pada pengujian KOH, biakan bakteri memiliki lendir dan bewarna bening keputihan, sehingga termasuk bakteri gram positif.

4.      Bakteri gram positif memiliki warna ungu atau biru dan mengandung protein, sedangkan bakteri gram negatif berwarna merah dan mengandung lemak.

5.      Faktor yang mempengaruhi hasil pewarnaan adalah fiksasi, peluntur warna, substrat dan lain-lain.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DAFTAR PUSTAKA

 

 

 

 

Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Malang.

 

Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Erlangga. Jakarta.

 

Lay. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali. Jakarta.

 

Soetarto. 1995. Bakteri dan Virus. Erlangga. Jakarta.

 

Sutedjo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.

 

Waluyo. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LAMPIRAN