PENGENCERAN BERSERI DAN PENGHITUNGAN MIKROBA SECARA TIDAK LANGSUNG DENGAN METODE SEBAR (HITUNGAN CAWAN)

 

 

 

 

 

 

 

PENGENCERAN BERSERI DAN PENGHITUNGAN MIKROBA SECARA TIDAK LANGSUNG DENGAN METODE SEBAR (HITUNGAN CAWAN)

(Laporan Praktikum Mikrobiologi Pertanian)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Oleh

 

Jenita Rahma Aulia

1614121012

Kelompok 3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

JURUSAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS LAMPUNG

2017

 

 

 

 

 

 

I.        PENDAHULUAN

 

 

 

 

1.1    Latar Belakang

 

 

Mikroba termasuk salah satu mahluk hidup yang tinggal secara berkoloni, misalnya bakteri dan jamur.  Dalam penelitian di bidang mikrobiologi, untuk mendapatkan suatu mikroba secara lebih rinci, maka dilakukan pemisahan koloni untuk memudahkan pengamatan dan penghitungan yang lebih lanjut.  Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada pada bahan  Sebelum menentukan jumlah mikroba, terlebih dahulu dilakukan teknik pengenceran berseri.  Pengenceran ini bertujuan untuk mempermudah dalam penghitungan mikroba.  Pengenceran harus sering dilakukan dalam beberapa tahapan, sehingga memperoleh tingkat pengenceran tertentu, biasanya sampai tingkat pengenceran keempat.

 

Setelah dilakukannya pengenceran berseri, maka dapat dilakukan penghitungan mikroba.  Penghitungan mikroba dapat dilakukan secara langsung maupun secara tidak langsung. Penghitungan mikroba secara langsung dapat menggunakan alat hemositometer dengan teknik menghitung jumlah mikroba secara keseluruhan baik yang hidup atau yang mati, sehingga tidak dapat dibedakan antara sel yang hidup dengan sel yang mati.  Penghitungan secara tidak langsung dilakukan untuk mendapatkan sel-sel mikroba yang hidup, yaitu dengan metode sebar atau hitungan cawan pada media yang cocok, setelah itu diinkubasi selama beberapa hari agar memperoleh pertumbuhan koloni yang maksimal.

 

Pengetahuan mengenai jumlah mikroba penting untuk mengetahui kualitas bahan atau tujuan lain berdasarkan jumlah mikroba.  Penghitungan mikroba secara langsung memiliki banyak kelemahan yaitu tidak dapat membedakan sel mati dan sel hidup, selain itu penghitungannya rumit karena sel mikroba sangat kecil dan berjumlah banyak.  Oleh karena itu, dalam percobaan ini penghitungan mikroba dilakukan secara tidak langsung agar mendapatkan sel-sel mikroba yang hidup saja, sehingga hasilnya lebih efektif.

 

 

1.2    Tujuan

 

 

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut.

1.        Mempelajari cara melakukan pengenceran berseri untuk menghitung jumlah sel bakteri atau jumlah spora secara tidak langsung.

2.        Mengamati pertumbuhan koloni bakteri atau koloni jamur dalam media PDA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

II.     TIJAUAN PUSTAKA

 

 

 

 

Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung.  Dimana jumlah terbaik adalah antara 30 sampai 300 sel mikrobia per ml, per gr, atau per cm permukaan.  Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah, sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit sedikit jumlah mikrobia, dimana suatu saat didapat hanya satu mikrobia pada satu tabung.  Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikrobia maksimal yang dapat dihitung, optimal setelah masa tersebut yaitu akhir inkubasi.  Selama masa inkubasi, sel yang masih hidup akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata (Waluyo, 2004).

 

Tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh.  Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran lebih tinggi, contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri).  Oleh karena itu, jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi, maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengenceran yang lebih tinggi, sehingga nilai maksimum dapat dihitung.  Metode pengenceran yang paling mudah dengan melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 tabung pengenceran sekaligus (Fridaz, 1993).

 

Beberapa cara penghitungan jumlah mikrobia yaitu cara penghitungan pada lempeng pembiakan, cara menghitung langsung (metode kaca objek), metode ukur kekeruhan, metode turbidimetri dan nefelometri serta dengan jumlah perkiraan terdekat.  Cara penghitungan pada lempeng pembiaakan disebut juga metode penghitungan bakteri hidup atau metode penghitungan koloni.  Penghitungan koloni dilakukan penyimpanan pada suhu yang sesuai.  Oleh karena itu, suatu bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat dalam tiap volum pengenceran yang digunakan.  Dalam hal ini pun, bahan pemeriksaan jika perlu harus diencerkan untuk menghindari jumlah koloni terlalu banyak, sehingga tidak dapat dihitung.  Hasil hitungan yang dapat diandalkan adalah antara 30-300 koloni pada tiap lempeng pembiakan (Agus, 2002 ).

 

Perhitungan jumlah bakteri secara langsung memiliki kelebihan dan kekurangan.  Kelebihannya, adalah waktunya yang digunakan singkat, penghitungannya lebih mudah, tidak membutuhkan bahan yang banyak., sedangkan kekurangannya adalah tidak dapat membedakan sel hidup dan mati dan sel yang berukuran kecil sulit dilihat dengan mikroskop.  Perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung dilakukan dengan metode plate count, yakni hanya sel yang hidup yang dihitung dalam metode ini.  Prinsipnya yaitu pengenceran dalam tiap konsentrasi diinokulasikan dalam medium agar dipetri dengan cara spread.  Perhitungan jumlah bakteri ini digunakan pengenceran 10^-3,10^-4,10^-5,10^-6, lalu dibandingkan jumlah koloni dari tiap konsentrasi pengenceran sehingga dengan mengikuti perhitungan dan persyaratan plate count akan didapatkan jumlah bakteri yang ada (Dwidjoseputro, 1978).

 

Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis.  Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm².  Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm.  Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil.  Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil.  Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm.  Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut, sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.  Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang digunakan, misalnya bila pewarna trypan blue dicampurkan ke dalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru.  Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi (Irianto, 2007).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

III.      METODOLOGI

 

 

 

 

3.1    Alat dan Bahan

 

 

Alat yang digunakan dalam percobaan ini antara lain colony counter (alat hitung coloni), atau hand counter, tabung erlenmeyer, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes dan gelas sebar.  Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri atau biakan jamur dalam cawan petri dan aquadest steril.

 

 

3.2    Prosedur Kerja

 

 

Langkah-langkah prosedur kerja dalam pengenceran berseri yang pertama dilakukan adalah cawan ditambahkan aquades sebanyak 10 ml di atas jamur atau bakteri yang telah disediakan.  Kemudian, diratakan menggunakan drigalski yang diputar di dalam cawan petri tersebut.  Larutan yang sudah tercampur, dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang disebut larutan stok, lalu diaduk menggunakan alat hot plate stirrer agar homogen.  Setelah menjadi 10 ml, larutan diambil sebanyak 1 ml yang dipindahkan ke tabung 2 yang sudah ditambahkan 9 ml aquades, kemudian diambil 1 ml dari tabung 2 yang dipindahkan ke dalam tabung 3 yang sudah ditambahkan 9ml aquades seterusnya sampai tabung ke-5.  Setelah sampai pada pengenceran ke-4, yaitu 10^-4yang berada di tabung 5, larutan tersebut diambil sebanyak 0,25 ml dan diletakkan di atas PDA, lalu diratakan kembali menggunakan drigalski.  Setelah itu, diamati koloni yang tumbuh dan dihitung jumlahnya.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IV.      HASIL DAN PEMBAHASAN

 

 

 

 

4.1    Hasil Pengamatan

 

 

Adapun hasil data pengamatan pada percobaan ini adalah sebagai berikut.

Kelompok	Cawan ke-	Pengenceran	Jumlah Koloni
3	1	10-3	1 hss	2 hss	5 hss
			(belum terlihat tumbuh)	(sudah terlihat mulai tumbuh)	(sudah tumbuh maksimal)
	2	10-3	(belum terlihat tumbuh)	(sudah terlihat mulai tumbuh)	(sudah tumbuh maksimal)

 

 

4.2    Pembahasan

 

 

Pada umumnya, dalam penghitungan jumlah mikroorganisme dilakukan pengenceran terlebih dahulu.  Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan cara menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar.  Pengenceran juga berarti sebagai suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, yaitu memakai aquadest dalam jumlah tertentu.  Dalam mikrobiologi, untuk mendapatkan jumlah koloni mikroba, maka dilakukan tingkat pengenceran tertentu atau disebut pengenceran berseri.  Pengenceran berseri adalah pengenceran yang seringkali harus dilakukan dalam suatu tahapan atau beberapa tahap untuk memperoleh tingkat pengenceran tertentu.  Pengenceran berseri dapat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah mikroorganisme yang benar.  Namun, pengenceran yang terlalu tinggi akan menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya relatif rendah.  Kegunaan dari pengenceran berseri yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan.  Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.  Pada perhitungan mikroba ini dilakukan pengenceran sampel agar jumlah koloni yang tumbuh pada cawan petri tidak terlalu banyak maupun terlalu sedikit, yaitu antara 30-300 koloni.  Semakin banyak pengenceran, maka jumlah koloni yang dihasilkan semakin sedikit.  Manfaat dari pengenceran berseri adalah untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspense bakteri/mikrobia.  Tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi mikrobia.  Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah sampel yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan mikrobia) dan pada pengenceran lebih tinggi sampel yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji positif (tidak ada pertumbuhan mikrobia).  Oleh karena itu jumlah populasi mikrobia yang ada dalam sampel diduga tinggi maka sampel harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengenceran yang paling mudah dengan melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 tabung pengenceran sekaligus.  Manfaat yang lain dari pengenceran berseri, yaitu dapat menghitung jumlah koloni dengan pengenceran tertinggi dan dapat menggunakan kontrol, sehingga hasil menjadi lebih baik (Dwidjoseputro, 1978).

 

Ada dua macam cara perhitungan jumlah mikroba, baik jamur maupun bakteri, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak langsung.  Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup, sedangkan perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja.  Untuk mengetahui perkembangan atau pertumbuhan suatu bakteri membutuhkan pembuatan media dengan metode perhitungan bakteri yang ada dalam media.  Ada banyaknya metode yang digunakan dalam menghitung jumlah bakteri secara kuantitatif dari suatu populasi bakteri (Volk, 1993).

 

Perhitungan secara tidak langsung adalah jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja, ini tergantung cara-cara yang digunakan.  Untuk menentukan jumlah miroba yang hidup dapat dilakukan setelah larutan bahan atau biakan mikroba diencerkan dengan factor pengenceran tertentu dan ditumbuhkan dalam media dengan cara-cara tertentu tergantung dari macam dan sifat-sifat mikroba.  Perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung memiliki kelebihan dan kekurangan.  Kelebihannya adalah dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi bakteri, bakteri yang dihitung adalah bakteri yang hidup, sedangkan kekurangannya adalah perhitungannya kurang akurat karena ada kemungkinan beberapa sel bertumpuk, ada kemungkinan terjadi spreader, waktu yang dibutuhkan cukup lama dan bahan yang digunakan relatif banyak.  Penghitungan secara tidak langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu:

1.        Penentuan volume total

 

Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hematokrit pada pengukuran volume total butir-butir darah, misalnya 10 ml biakan dimasukkan ke dalam tabung reaksi khusus (tabung hopklins) yang bagian bawahnya berupa silinder dan bergaris ukuran.

2.        Metode turbidometri

 

Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur kekeruhan suspensi atas dasar penyerapan dan pemencaran cahaya yang dilintaskan, sehingga yang mengandung lebih dari 107-108 sel/ml, tampak lebih keruh oleh mata telanjang.  Suatu volume biakan yang telah ditakar ditempatkan dalam tabung khusus yang jernih dengan diameter tertentu (Hadioetomo, 1990).

 

Dari data pengamatan yang telah kami dapatkan, maka dapat dilihat bahwa untuk menumbuhkan suatu mikroba dibutuhkan proses pengenceran.  Pengenceran yang kami lakukan adalah pengenceran berseri yang dilakukan sampai tingkat 10^-4.  Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memperoleh tingkat pengenceran tertentu, kemudian dari larutan stok tersebut digunakan untuk tingkat pengenceran pertama sampai kelima.  Tingkat pengenceran berseri yang dilakukan oleh kelompok kami, yaitu tingkat pengenceran ketiga.  Pengenceran ketiga dilakukan dengan mengambil 1 ml dari tingkat pengenceran kedua, kemudian dipindahkan menggunakan pipet tetes ke tabung 3 yang berisi air 9 ml.  Setelah itu, larutan tersebut, dituangkan kedua buah cawan petri di laminar dalam keadaan steril.  Pengamatan dimulai dari hari kamis, jumat dan senin.  Hasil pengenceran berseri dengan metode sebar tersebut per harinya mengalami perubahan.  Pada hari pertama pengamatan, koloni bakteri belum nampak tumbuh di dalam cawan, cawan masih terlihat sama seperti hari dilakukannya percobaan.  Pada hari kedua, kedua cawan terlihat dengan keadaan yang berbeda, yaitu kedua cawan, koloni bakteri yang mulai tumbuh menampakkan warna hijau tua yang masih kurang terang atau masih remang-remang.  Pada hari ke 5, yaitu hari senin jumlah koloni semakin banyak yang ditandai dengan pekatnya kumpulan warna hijau di dalam kedua cawan tersebut.  Jadi, percobaan yang kami lakukan pada tingkat pengenceran ketiga berhasil karena koloni bakteri dalam cawan tumbuh.  Dari hasil tersebut, bahwa pada tingkat pengenceran 10^-3 koloni bakteri yang didapatkan cukup terlihat banyak, sehingga harus ada tingkat pengenceran kembali yang lebih besar dari 10^-3 agar mendapatkan pertumbuhan koloni yang semakin spesifik dan maksimal.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

V.     KESIMPULAN

 

 

 

 

Adapun kesimpulan dari percobaan ini adalah sebagai berikut.

1.        Larutan stok yang dibuat digunakan untuk melakukan tingkat pengenceran.

2.        Pengenceran tingkat 10^-1 sampai 10^-4 bertujuan untuk memperkecil koloni bakteri yang terdapat di dalam cawan,sehingga mempermudah penghitungannya.

3.        Koloni bakteri mulai tumbuh ketika pada hari pengamatan kedua dan mulai tumbuh maksimal pada hari kelima.

4.        Koloni bakteri yang tumbuh ditandai dengan adanya keruh warna hijau tua yang saling bertimpahan.

5.        dari hasil pengematan, pada tingkat pengenceran ke-10-3 koloni bakteri yang tumbuh cukup banyak, sehingga dibutuhkan pengenceran yang lebih lanjut.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DAFTAR PUSTAKA

 

 

 

 

Agus, M. 2002. Mikrobiologi Terapan. Universitas Muhammadiyah. Malang.

 

Dwidjoseputro. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

 

Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo Persada. Jakarta.

 

Hadioetomo, R. 1990. Mikrobiologi Dasar-Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

 

Irianto, K. 2007. Mikrobiologi. Rama Widya. Bandung.

 

Volk. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Erlangga. Jakarta.

 

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LAMPIRAN